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细胞系错误鉴定:终结的开始
时间:2015-12-15 来源:www.hybribio.cn 浏览:24509

2010年5月ATCC SDO(Standards Development Organization)工作组在Nature review cancer杂志上发表了题为《Cell line misidentification:the beginning of the end》前瞻性报道。以下是全文内容。

摘要:

细胞系作为正常或肿瘤组织的模式细胞被广泛应用于科学研究和药物开发,然而很大一部分的细胞系被错误标记或被其它个体、组织、种系来源的细胞所替代,由于科学界无法解决此类问题以致大量因使用错误鉴定的细胞系而导致误导或存在潜在错误的学术论文发表。通过近年来的努力而开发出的STR分型方法已成为对人源细胞进行鉴定的标准方法,STR分型的应用成为根除细胞错误鉴定这一问题的重要一步。

细胞系作为体外模型而被广泛应用于生物医学研究。正确数据的获得常常依赖于细胞系的特性,尤其是当它用来替代其来源者的组织时。令人感到惊讶的是,细胞错误鉴定的发生率却不低,以致原来把某一细胞归为另一细胞系的来源者通常都是错误的?。细胞错误鉴定问题已有50年历史,基于国际细胞库的分析数据显示:1977年细胞错误鉴定率为16%,1999年为18%,直到最近几年,应用于生物医学领域的细胞系需要鉴定的问题仍然很少有人关注。于是ATCC标准开发组织工作组ASN-0002(SDO,一个目前正在开发人类细胞系鉴定标准的工作组)成员写了这篇科学与社会文章。ATCC SDO成立于2007,旨在开发最好的应用于生命科学的标准,及使用一致的工序来平衡工业界、政府、协调部门和学术界的意见。我们期望此标准草案能够在2010年得到公众的审查和评论,随后,最终草案被美国国家标准研究院(ANSL)批准。

这里我们描述了细胞错误鉴定形成的原因、给科学界带来的影响和历史、,以及为解决此问题所做的努力。我们讨论了目前能用于细胞鉴定的不同方法并推荐使用STR分型来鉴定人类细胞系。或许因为其重要性,一个通用的STR分型数据库正在建设当中。

细胞错误鉴定的发现

人类和动物细胞培养物的错误鉴定是一个长期的问题,最初意识到此问题可追溯到上世纪50年代。核型分析和免疫学方法最先被应用于细胞鉴定,当大量的种系错误鉴定被报道后,促使ATCC在1962年建立细胞系鉴定库。

种内的细胞在1962年还不能鉴别,到1966年Stanley Gartler引入生化多态性的概念来对人类细胞进行鉴别(基于同工酶的表达)。1966年,在关于细胞、组织及器官培养的第二个十年回顾会议上,Gartler报道了这样一个现象:据推测来源于18个独立个体的细胞系却全是Hela细胞(Hela细胞为人类第一个被建立的细胞系),例如包括来源于正常肠上皮细胞(Int-407)、正常羊膜细胞(WISH)、正常肝细胞(Chang liver)、喉癌(Hep-2)和口腔癌(KB)。Hela细胞来源于一位名叫Henrietta Lacks的宫颈腺癌患者,由于Hela细胞享有非凡的地位所以它被分派至世界各地,流行于各实验室之间。因此,直到如今,许多科学家都还未察觉到Hela细胞存在与其它细胞发生交叉污染的可能性。Hela细胞具体极强和快速的生长能力,由于生长过快以致它会很快抑制其它细胞的生长。

否认和自满

对于Gartler的发现,一些人甚至那些应该知道更多的科学家们都表现出了抵制和敌对的态度,但是有一位科学家Walter Nelson-Rees,对Gartler的话引起了特别注意。Nelson-Rees承包了一家从属于国家肿瘤研究院的细胞库,他与同事们开发出一种利用核型分析来对细胞进行鉴定的方法,他在一系列发表的文章中指出:在送至细胞库的培养物中,据称为一个独特的细胞培养物里面却存在大量的交叉污染,Nelson-Rees的工作表明,由Hela细胞引起的交叉污染极为普遍,甚至经过多年后所有的细胞系都可能被怀疑是Hela细胞,除非可以证明它不是。Nelson-Rees不仅在科学文献中提出需要注意交叉污染问题,他还通过信函通知受此问题影响的科学家。Nelson-Rees对细胞鉴定最后的贡献于2009年发表(逝世后不久)。

当Nelson-Rees第一次公布他的发现时,一些科学家根本不予理睬甚至否认他的证据,并继续发表包含错误信息的学术论文。结果,Nelson-Rees在想不出任何办法下只得对使用了污染细胞系的论文或个人进行了标注。在那个时代(也许今天),Nelson-Rees的行为被认为是非科学的,他受到了许多同僚的攻击。他将自己标榜为治安维持会会员,1981年,NIH终止了与他的合同。自从那以后,细胞错误鉴定现象愈演愈烈,问题逐步扩大。接下来的10至20年内,细胞库分发了许多错误命名的细胞。

评估由交叉污染或细胞错误鉴定而产生多少误导性和错误的研究是困难的。从1969到2004年,错误鉴定培养物的使用在PubMed数据库中增加了大约10倍,而使用培养细胞发表的论文仅增加了2-2.5倍。到2004年,Hela细胞只是冰山一角,许多其他细胞系在不同“外衣的伪装”下盛行于世界各地实验室。

一项针对正在从事细胞培养的工作人员调查显示:483例被调查者中,32%使用了Hela细胞,9%的人在不知情下使用了Hela污染物,只有33%的调查者对他们使用的细胞进行了鉴定。35%的人获得细胞的途径是其他实验室,而不是大的细胞库。

在过去的超过50年的时间,对于细胞错误鉴定问题,尽管有人会自鸣得意,并在一些情况下人们最初的反应为否定,但仍有一小部分的人致力于补救此问题。在个人努力中其中占大部分的是相关人员写信给编辑要求审稿人注意细胞错误鉴定问题,以及要求作者提供证据以证明在研究中使用的细胞系既没有交叉污染也不是错误鉴定的细胞。但这些努力在Nelson-Rees的合同终止后大部分都被忽视了,尽管当时DNA指纹识别技术的出现带来了新的和更多再生的方法,这一技术在90年代初期一再揭示了细胞错误鉴定的程度。

2004年,Roland Nardone开始了第二次的改革运动,他得到了后来成为ATCC 标准制定组织副主席的Joseph B. Perrone的支持,Joseph B. Perrone不仅为他提供了许多的主意,并且还提供了激发这场改革运动的所需要的义愤。与其他相关的科学家一起,Nardone提出了一个全面而相互协调的倡议,以同时寻求引起对此问题本质和重要性的意识和请求受此问题影响的组织和个人的参与,这些组织包括NIH,Howard Hughes医学院。

案例和影响

交叉污染和错误鉴定已有一段很长的历史,这其中有许多的案例,我们很难去判断哪一个是最重要及代价最高的。

已被描述的经典案例是Hela细胞污染(关于Hela细胞污染有好几个案例),令人惊奇的是,许多被Hela细胞污染的细胞系居然在一些备受尊敬的杂志上仍被使用,而这一使用距离它们最先发现为Hela细胞的时间长达40年之久。

T24是另外一种生长快速的细胞系,它常常污染许多经推测来源于不同膀胱癌的细胞系。EVC304最先被认为是自发转化的人类正常内皮细胞系,但后来却发现它是T24膀胱癌细胞系。令人感到意外的是,EVC304不是内皮细胞的这一论述对它作为内皮细胞模型的公开发表几乎没多大影响。

推测来源于人类的前列腺癌细胞系TSU-Pr1和JCA-1也是来源于T24膀胱癌细胞系。这些研究发表在杂志Cancer Research上,但它并不能阻止后来一篇TSU-Pr1作为前列腺癌细胞系模型的研究论文发表在Cancer Research上。

DNA指纹分析揭示NCI/ADR-RES细胞系实际上为卵巢肿瘤细胞系OVCAR-8,而不是乳癌细胞系。大约有300篇已发表的论文使用了错误鉴定的NCI/ADR-RES细胞系。NCI/ADR-RES包含在NCI60细胞,两者STR分型相同。

1篇描述食管细胞系错误鉴定的论文宣称:基于这些被污染的细胞而产生的实验结果导致继续的临床试验需招募EAC(食管腺癌)病人,以及需得到超过100多个刊物和至少三个NIH肿瘤研究所的承认,还牵涉到11个US专利。

长达50年的压制,为什么?

这里有三大群体需对细胞错误鉴定负责:科学家个人、科学期刊、资金管理部门。在过去50年大部分时间里,只有科学家个体对此问题提出了抗议。然而要想摆脱许多科学家故意公然使用错误鉴定的细胞系这一结论是很难的,再者,作者通常会很不情愿发表一项基于使用错误鉴定细胞的声明。

John Maddox,Nature杂志的编辑,在1980年针对引人注目的交叉污染问题写了一篇评论,标题为“科研工作需为诚信负责”。尽管他对此问题几乎完全缺乏洞察力,但他提出建议:没有理由怀疑众所周知的少数几个案例在任何意义上只是交叉污染问题的冰山一角。在相同的评论里,一些科学家们像Nelson-Rees遭受诽谤,因为这篇文章指出:如果这些文明行为(即科研中的诚信问题)遭到自诩为治安团成员的破坏,那么它将成为一场灾难。细胞系交叉污染的历史暗示诚信并不像许多科学家们希望相信的它适用于世界各地科学界的那样。

与此问题相关的科学杂志编辑的回应继续不断地得到启发。数百篇科学杂志文章描述了细胞错误鉴定的事例,但直到现在,科学杂志或资金管理部门还没有采取根除此问题的行动。

一个很有影响力的组织培养期刊的编辑被邀请考虑将细胞鉴定作为发表论文的必要条件,但他回应说:那将是财政自杀。其它期刊的编辑也拒绝考虑这一质控方案,他们认为一旦引进这一发表论文的障碍,那些有意愿投稿至他们杂志的作者人数将会大大减少。

在过去的两年里,态度开始发生改变,一些期刊如In Vitro Cellular and Developmental Biology、International Journal of Cancer、Cell Biochemistry 和Biophysics and the American Association for Cancer Research(AACR) journals要求细胞系在发表前需做鉴定。Nature杂志指出:首先基金组织必须要求细胞进行鉴定并提供必要的资金。一旦他们这样做了,Nature将会在文章发表之前要求细胞鉴定。与此同时,基金组织继续对此问题置之不理。

基金组织是维持科学标准最有权力的部门,但令人惊奇的是,他们拒绝考虑处理甚至不承认细胞错误鉴定问题。例如,NIH发表于2007年的通告忽视了科学家个体和审稿人未能解决细胞错误鉴定这一问题。一位Nature编辑指出:这一通告只不过让人强迫接受这一现状。

一些科学家个人尝试去解决这一问题,但却遭遇来自基金部门不予帮助的回应,他们要么趋于否认要么将问题弱化。来自Cancer Research UK的一位资深科学家最近的一项声明提出:细胞错误鉴定问题每一年都有抬头。基金部分似乎已受到这个问题的威胁并对试图解决这一问题的科学家们加以抵抗,另外基金部分对那些试图寻找解决方案的科学家予以非难以及使他们丧失名誉。

任何在美国或英国的支持生物医学研究的主要基金部门本应在过去的10年里面根除细胞系错误鉴定问题,而根除这一问题所需经费要少于科学与社会所公布的基金部门提供给每一项目的平均经费。然而,这些基金部门一次又一次地忽略,或是在某些情况下压制有关这一问题的争论,并且继续为使用错误细胞的研究项目提供资助。有关基金部门对科学进行歪曲和欺骗控制这一角色可能存在更大的牵连。

对于细胞系错误鉴定问题不管是期刊还是基金部门都应是无法容忍的。有迹象表明,Nardone的“讨伐”运动正在不断地获得影响力,并且人类细胞系鉴定的标准将会成为Nardone遗产中一个明确的证据。

细胞错误鉴定的根源

大部分的细胞系在学术环境中被建立,在学术环境下,组织培养通常被认为是一种对技能少有要求的技术,其所用到的必要设备如流动柜和孵育箱使用起来没什么限制。在这些情况下,尝试建立一种新的细胞系通常会导致交叉污染是不足为怪的。在送至德国的微生物和细胞培养收藏所的550个个白血病和淋巴瘤细胞系中,59/395(15%)被初创者送来的细胞系以及23/155(15%)的二级来源是错误的。可以推测大部分二级来源的细胞系已被交叉污染或被初创者错误鉴定。

有许多缘由可以引起细胞培养物错误鉴定,每一个实验室都存在风险。或许细胞错误鉴定最直接的原因就是在常规操作过程中对细胞培养容器进行了错误标记。造成这种问题出现的原因有:实验员的工作负荷、缺乏注意以及在细胞操作过程中的分心。

培养物的交叉污染以及随后污染细胞的过量生长是另一个引起细胞系错误鉴定的常见原因。这种情况发生的几率在以下条件会增加:试剂的共用、在再喂养操作时反复使用相同的试管、在没有充分分离每一细胞类型情况下同时对多个培养物进行操作。当交叉污染发生时,一种细胞类型迅速生长而超过另一种,在4-5次细胞传代后,一个纯的污染细胞培养物将会形成。

在使用其它物种的滋养层(例如小鼠3T3细胞)来繁殖人类干细胞或原始细胞时有意地共培养会导致交叉污染或人类细胞系过生长。正常情况下,滋养层细胞处于无增殖状态,但只要生长抑制程序不完全,它就会不断繁殖并逐步取代人类细胞。体细胞杂交虽不常见但也会发生,如人类套细胞淋巴瘤细胞系NCEB-1就携带了小鼠的七条染色体。

异种移植也会导致细胞系交叉污染和错误鉴定,来自异种移植的复苏细胞会被宿主动物细胞所替代。

一般而言,交叉污染最终的结果将会是少量适应细胞完全且快速的替代。两个细胞系不能持续共存于同一个培养环境,除非它们是共生关系,但这种情况据我们所知还未有报道。一个细胞群经过许多次传代后还能包含一个稳定的混合基因组,唯一已知的情况是接续的体细胞杂交。

简单、经济的质控措施能够阻止或至少会减少细胞错误鉴定的发生。由于缺乏重视及未采用质控措施导致细胞错误鉴定现象极其普遍。大量质控措施的实行以及相应文件的适当调整被认为是生物制药领域出现相对较低细胞错误鉴定报道的因素。

交叉污染检测

许多方法已被用来检测交叉污染,包括同工酶分析、核型分析、人类白细胞抗原(HLA)分型,免疫分型和DNA指纹识别。这些方法都可以鉴别出某一种细胞系,但是分辨能力各不一样。然而,这些方法在不同实验室所得到的数据却不尽相同,以致没有任何一种方法可以用来建立一个标准参考数据库。

许多实验室利用STR分型来鉴定人源细胞系。STR分型是一种用来做亲缘分析的方法,它的原理是在一单管中同时扩增多个多态性DNA片段。STR位点是由不同数目重复单元组成的重复DNA序列。每一个STR位点均能被扩增且扩增产物标记上不同颜色的荧光,使得扩增产物很容易通过片段大小和颜色来区分。STR分型快速、经济、易于自动化,能得到可重复的数据,且数据格式适合建立一个标准参考数据库。由于快速、鉴定的细胞系结果明确,STR分型的应用价值最大。

STR分型——潜力及局限

3-5个碱基重复的DNA重复序列已常规性地用来做亲缘鉴定、法医鉴定、以及鉴定在20年之前的大灾难中遇难的受害者。随后,STR分型用于细胞鉴定中。用STR分型来做细胞鉴定有几大优势。

肿瘤细胞系包含许多遗传改变,因此用STR分型来分析肿瘤细胞系的标准必须与正常组织不一(见补充信息Box3)。肿瘤细胞通常会表现出杂合性丢失(即缺失一个等位基因以致难以与纯合子相区分),另外由于DNA复制,肿瘤细胞可携带等位基因的多个拷贝。与此类似,在肿瘤细胞培养过程中,肿瘤细胞系既可失去等位基因的一个拷贝,也可偶尔获得一个拷贝。所以,相同细胞系的亚系可能会含有不同的STR分型。

对比相同的等位基因,已往发表的数据表明,75%的一致性已能鉴别出所有已知的交叉污染细胞系,一致性超过50%的两个细胞系不会认为是来源于不同个体,因此,在单一细胞系和存在交叉污染的细胞系之间存在25%的“缓冲区”,任何细胞系只要一致性水平在50%和75%之间,它就应该认为是可疑的。

在分析人类细胞系基因型中,其主要的问题包括杂合子峰高不平衡(即一等位基因的峰高或面积远大于另一等位基因)、某一基因座出现多个等位基因、等位基因丢失(目的片段未能扩增)。由于肿瘤细胞系为非整倍体,所以其杂合子峰高不平衡以及在一个或多个基因座出现多个等位基因的现象非常典型。

基因分型所需费用是大家主要关心的问题,但是相对于细胞系的整个工作来讲其费用就微不足道了。STR分型的费用包括DNA提取、STR 位点的PCR扩增、毛细管电泳分离扩增片段和数据分析。增加STR基因座的数目如从6个到15个将会达到一个非常高的分辨率。

STR分型存在一个大的局限,就是它不能检测来源于其他物种的污染细胞,哪怕是人类细胞被过生长的其它物种细胞所覆盖,用人类或高等灵长类特异性引物也不会有DNA扩增。在PCR中采用用物种特异性引物可以用来检测来源于其它物种的污染细胞。如果应用于其它物种的STR分型已被建立(目前局限于少数几个具有重要商业价值的物种),STR分型无疑可被用来鉴定污染细胞。

对于大部分已被建立的细胞系,供体组织已不能获得,那些被广泛使用的细胞系其最初来源者要么退休要么已辞世。在这些情况下,一种基于储存于细胞库中可能是最老的细胞群假想出现了。这些分型将需要标记上“临时”来指示缺乏对最初供体组织的分型鉴定。

在下面描述的数据库可用之前,能用来对比STR分型的可用资源极为有限。ATCC和DSMZ细胞库网站,以及CLIMA(细胞系分子鉴定整合数据库)提供了一些信息,至少两种系列的STR分型数据已公布。目前,最有用的资源之一是Amanda Capes-Davis 和Ian Freshney收集的错误鉴定细胞系清单,这在欧洲细胞培养物收藏所(ECACC)网站上也可查看。所有的科研工作者都应对照这一清单来核对他们正在使用的细胞系名称。

交互式数据库

有人提议建立一个旨在开发可用STR分型数据的数据库,这些数据可作为人类细胞系鉴定的数据。交互式数据库任何人都可进入,但只有数据库管理员才能对数据进行修改或补充。这个数据库不仅提供DNA分型,还能允许实验室将他们的细胞系STR分型数据与数据库里的细胞系数据相比较,这样便于确保实验数据的可靠性。

通用标准是组成一个好的数据库的必备条件,应用细胞鉴定的标准可以建立起一个由每一个有确定STR分型的单一细胞系组成的交互式数据库,并为STR分型检测以及分析提供必备条件。标准制定委员会的成员将会与NCBI协作开发交互式数据库所需要的条件,数据库由NCBI维护。数据库最初只包含科研人员常用的并保存在大型细胞库的500个已证实的细胞系。

每一个细胞系在被提交至数据库之前都会确定其STR分型。比对STR分型数据最有效的数据库会由一组常见的标记物组成。然而,并不是所有的数据都是收集相同的STR位点或是用同一代的测序仪器得到的。针对相同的STR标记使用不用引物组合是法医和人身份鉴定中的惯例,美国的联邦调查局联合DNA索引系统(CODIS)就是采用13个核心STR位点组合来录入数据的。为了能维持进入CODIS的数据之间的整合,各实验室必须使用CODIS认可的STR分型试剂盒和仪器,并且严格按照质量保证标准来操作。CODIS认可的试剂盒已经历了大量的验证研究,包括旨在解释使用不同引物组合时出现STR分型差别的一致性研究。相同的程序会是细胞STR分型所必需的。

未来

从增加的数据可信性、只需很少的时间和费用,以及研究被错误鉴定的细胞系的所花费的精力来看,细胞系STR分型鉴定将会在科学研究中产生重大影响。细胞系的精确鉴定在研发基于细胞下的医学产品起到至关重要的作用,它能避免将人体细胞暴露于错误鉴定细胞中的风险。尽管这种错误鉴定大部分可以通过遵循质控措施而避免,例如正确标记、在生产基于细胞的医学产品时采取跟踪计划,但是当用来证实一个来源于预期供体的细胞产品以及它被有意地与其它供体细胞混合时,利用可明确鉴定细胞和组织的标准方法将会提供安全保障。这个问题对于个体化医疗和应用基于干细胞的技术(包括诱导多能干细胞)非常重要。

没有一个单一的方法可提供所有的信息来鉴定一个人类细胞系。STR分型是这一时期的最佳代表,因此,随着新信息的可用,STR分型标准将会不断地改进。向任何人开放的交互式、可搜寻的数据库将会大大减低错误鉴定细胞的使用率。基金部门和期刊也被鼓励采取对使用错误鉴定细胞“零容忍”的政策并要求作者提供证据以支持其使用的为正确的细胞系。

 

文献来源Cell line misidentification: the beginning of the endNat Rev Cancer, 2010. 10(6): p. 441-8.

 

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